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植物基因工程（第二版） 
定 价：78 元 丛书名：普通高等教育“十一五”国家级规划教材普通高等教育“十二五”规划教材
9 7 4 8 1 7 0 0 9 3 0 0 0 读者对象:生物（工程）技术专业、植物育种等专业的师生和科研工作者 
《植物基因工程》是融汇了近代植物基因工程新理论、新技术及新成果编写而成的系统论述植物基因工程原理与技术的“十二五”高等院校统编教材。《植物基因工程》对第一版进行了较大的改动，共设八篇46章，新增了“植物基因变异分子生物学”、“植物质体基因转化系统”及“外源基因在转基因植物中的表达调控”等共20余章，最后还增加了第八篇生物信息学与植物基因工程，新增内容为《植物基因工程》的三分之二以上。同时，《植物基因工程》引入了许多最新的图表及近三年的新文献，力求图文并茂，内容丰富，既具有较高的专业水平，又深入浅出，使《植物基因工程》具有多种功能。
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《植物基因工程》既是植物基因工程领域研究人员的参考书，又是高等院校生物技术相关专业本科生及研究生的教材，教师可以根据教学大纲需要从中选择适合的内容灵活使用。同时，《植物基因工程》也是学生拓宽知识、激发专业兴趣、启蒙创新的深入阅读资料。
全球生物技术的快速发展使生命科学进入了大科学、大数据时代，其影响力远超人们想象。生物科技创新成果层出不穷，产业大军厉兵秣马，无不预示着生物产业春天已然来临。生物医药、生物农业及生物产品制造“三足鼎立”的格局基本形成。基因工程是生物大时代的开拓者，其中植物基因工程与农业发展、人民生活息息相关，从而得到了高度重视，产业化的进程急速递增。1996年至2012年的17年间，全球种植以抗病虫、抗除草剂性状为主的转基因作物面积从170万hm真增长到1．7亿hm2，增长了近100倍，创造了一千亿美元价值，相当于节约了16．3亿亩耕地；减少了4．73亿化学农药的使用，业绩举世瞩目。这一崭露头角的新兴产业方兴未艾，解决全球粮食危机寄希望于植物基因工程的未来。植物基因工程与历史上其他的重大农业技术相比，如化学革命从有机肥到无机肥的推广用了半个多世纪，可见转基因发展之快。在生命科学家眼中，植物基因工程是一项给人类带来福祉的伟大技术，也是将为农业谱写文明新篇章的技术。直至今日，联合国粮食及农业组织对30年前获得第一株转基因植物的三位科学家(有的科学家已去世)授予了崇高“世界粮食奖”，奖励他们对世界农业的巨大贡献，这也是首次对转基N'f乍物的高度肯定。农业生物科技新时代已经来临，全球农业生物育种和产业化发展已进入战略机遇期。
我国已开展2。多年转基因技术研究，拥有重要基因的自主知识产权和核心技术，在棉花、水稻、玉米等作物转基因应用研究方面，已形成优势与特色，达到国际先进水平。我国种植的棉花中8。％是转基因抗虫棉，减少了约8。％的农药使用量。我国对植物基因工程高度重视，2008年投巨资启动了“十一五”和“十二五”植物基因工程育种专项，已对7种转基因植物发放了商品化生产许可，有力地推动了我国植物基因工程产业的发展。 科技发展，人才为本。早在1993年，本书编者、国务院特殊津贴专家王关林教授在美国从事植物基因工程研究时就致力于编写植物基因工程专著，旨在加快我国人才培养。于1998年他编著了第一部专著《植物基因工程原理与技术》，2002年又改编出版了《植物基因工程》第二版并多次重印。在此基础上，2008年根据我国教育部的教材建设规划要求，由专家组评审，教育部审批，王关林教授又承担了编写我国普通高等教育“十一五”国家级规划教材《植物基因工程》的专项任务。该书是我国植物基因工程领域内的第一本高等院校统编教材，于2009年由科学出版社出版后，被中国科学院研究生院及多所大学遴选为本科高年级学生和研究生的教科书，使用五年来多次得到好评。为紧跟生物科技大时代的发展，导人近期植物基因工程的创新成果，在第一版的基础上，编者汇集近代的新理论、新技术及其产业化进展，编写了系统论述植物基因工程基础理论及其原理与技术，教学科研两用的新作——《植物基因工程》第二版，以克服两者脱节的弊病，提高本书的使用率。教材是传授知识的载体，是培养人才的保证。编者深知责任重大，求贤为业，竭诚邀请了来自中国科学院遗传与发育生物学研究所、中国农业科学院、北京大学、清华大学等院校教学科研一线的教授、专家、中青年博士参加编写，集成他们的渊博学识和真知灼见，提高著作水平。 本书保持了原专著和第一版教材的特点：强化基础理论，重视知识体系；融合学术创新，汇集科技成果；做到理论与技术结合，理论与实践结合，理论与应用结合；注意激发读者的专业兴趣和激情，培养创新能力。本书以植物基因工程的操作程序为主线循序展开，逐渐深入，在论述植物基因工程学科理论的基础上，系统阐明了植物基因工程各程序的原理与技术，使本书既具有较高的理论性，又具有较强的实用性和可操作性，从而构成植物基因工程完整的理论体系，也为植物基因工程学科的确立奠定基础。 新版《植物基因工程》中删除了“植物基因工程实验技术篇”，拟将该内容独立编写成《植物基因工程实验指南》，与本书配套，本书改编的主要内容：一是在第一篇植物基因工程分子生物学中新增了第4章植物基因变异分子生物学，首次综述了植物基因损伤、突变与修复的分子机制及其与转基因的同理性，从而深化了植物基因工程的基础理论。 ……
目录
前言 绪论 植物基因工程概述 1 1 植物基因工程的定义 1 2 植物基因工程的研究发展历史 2 2.1 植物基因工程理论形成期 2 2.2 植物基因工程的问世期 3 2.3 植物基因工程的发展期 4 3 植物基因工程的理论基础及技术路线 4 3.1 理论基础 4 3.2 植物基因工程的技术基础 5 3.3 植物基因工程的技术路线 5 4 植物基因工程研究的内容 6 4.1 植物基因工程的基础理论研究 6 4.2 植物基因工程的应用研究 6 5 植物基因工程的发展前景 7 复习题 8 名词解释 8 问题 8 第一篇 植物基因分子生物学 第1章 植物基因组的结构功能及特点 10 1 植物基因组与基因组学的基本概念 10 1.1 植物基因组的定义 10 1.2 基因组学的概念 10 2 植物基因组的结构特点 11 2.1 植物基因组的大小与C值复杂性 11 2.2 植物基因组的简单序列 11 2.3 植物基因组的重复序列 11 2.4 植物基因组的多态性 13 2.5 植物基因组的密码偏爱性 13 3 植物细胞三套基因组的结构功能 14 3.1 植物细胞核基因组的结构特点 14 3.2 植物线粒体基因组的结构特点 14 3.3 植物叶绿体基因组的结构特点 15 3.4 植物细胞三套基因组的结构功能比较 15 4 植物细胞三套基因组的遗传关系 16 4.1 三套基因组的混源DNA 16 4.2 叶绿体中蛋白质的基因编码及核质调控 16 4.3 线粒体中蛋白质的基因编码及核质调控 17 4.4 植物细胞三套基因组之间的相互调控 17 复习题 18 名词解释 18 问题 18 第2章 植物基因的分子结构功能及特点 19 1 植物细胞核基因的分子结构功能及特点 19 1.1 植物细胞核基因的基本结构 19 1.2 植物细胞核基因的分子结构特点 19 1.3 植物细胞核基因的功能及类型 22 2 植物叶绿体基因的分子结构功能及特点 22 2.1 叶绿体基因的基本结构 22 2.2 叶绿体基因的分子结构特点 22 2.3 叶缘体基因表达调控特点 23 3 植物线粒体基因的分子结构功能及特点 23 3.1 线粒体基因分子结构特点 23 3.2 线粒体基因的表达调控特点 24 4 植物核基因、叶绿体基因和线粒体基因结构功能的比较 24 复习题 25 名词解释 25 问题 25 第3章 植物基因的表达调控特点 26 1 植物基因表达在染色质水平上的调控特点 26 1.1 植物染色质MAR的调控 26 1.2 DNase I超敏位点的调控 27 1.3 DNA甲基化对基因表达的调控 27 2 植物基因表达在转录水平的调控特点 27 2.1 转录因子调控 27 2.2 增强子、沉默子及Kozak序列调控 28 3 植物基因转录后水平的调控特点 28 3.1 选择性剪接 28 3.2 小分子RNA的调控特点 28 4 植物基因翻译水平的调控特点 29 4.1 调控因子的磷酸化和脱磷酸化调节 30 4.2 前导序列调控 30 4.3 移码和选读 30 5 翻译后水平调控特点 30 5.1 多肽链折叠调控 30 5.2 肽链的修饰调控 30 5.3 蛋白质的降解 31 复习题 32 名词解释 32 问题 32 第4章 植物基因变异分子生物学 33 1 植物基因组变异 33 1.1 染色体组的倍性变异 33 1.2 同源染色体配对错误性变异 33 1.3 有性杂交基因重组变异 33 2 植物基因变异 33 2.1 DNA损伤 33 2.2 基因突变 35 3 植物DNA损伤、突变及修复重组 36 3.1 直接修复 36 3.2 切除修复 36 3.3 错配修复 36 3.4 双链断裂修复 37 3.5 跨损伤DNA合成 37 4 植物基因变异的生物学效应及其应用 37 4.1 性状改良 37 4.2 新品种培育 38 5 植物转基因与基因变异的同理性分析 38 复习题 38 名词解释 38 问题 38 部分近期参考文献 39 第二篇 植物基因工程的目的基因 第5章 抗植物虫害基因及其应用 42 1 微生物来源的抗虫基因及其应用 42 1.1 加基因 42 1.2 胆固醇氧化酶基因 44 1.3 营养杀虫蛋白基因 44 1.4 其他微生物来源的抗虫基因 44 2 植物来源的抗虫基因及其应用 45 2.1 蛋白酶抑制剂基因 45 2.2 植物凝集素基因 46 2.3 淀粉酶抑制剂基因 47 2.4 系统肽基因 47 2.5 其他植物来源的抗虫基因 47 3 动物来源的抗虫基因及其应用 48 3.1 星虫特异性神经毒素基因 48 3.2 其他动物来源的抗虫基因 48 4 非蛋白质类杀虫剂调控基因 48 5 抗虫基因的互补和协同作用 49 复习题 49 名词解释 49 问题 49 第6章 抗植物病毒基因及其应用 50 1 病毒基因及其应用 50 1.1 病毒基因介导的抗性机制 50 1.2 cp基因及其应用 50 1.3 非病毒结构基因及其应用 52 1.4 缺陷干扰RNA 53 1.5 病毒卫星RNA 53 1.6 核酶基因 53 2 植物体内的抗病毒基因及其应用 54 2.1 病程相关蛋白基因 54 2.2 核糖体失活蛋白基因 54 2.3 其他植物内源基因 55 3 干扰素基因及其应用 55 3.1 干扰素的抗病毒原理 56 3.2 干扰素基因的应用 56 4 抗体基因及其应用 56 4.1 抗体基因的抗病毒原理 56 4.2 抗体基因在植物中的应用 56 复习题 57 名词解释 57 问题 57 第7章 抗植物真菌病害基因及其应用 58 1 抗菌物质相关基因及其应用 58 1.1 植物抗毒素（植保素）基因及其应用 58 1.2 核糖体失活蛋白基因及应用 58 1.3 多聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白基因及其应用 59 2 病程相关蛋白基因及其应用 59 2.1 病程相关蛋白种类 59 2.2 病程相关蛋白基因及其应用 59 3 植物抗真菌病R基因及其应用 62 3.1 植物抗真菌病R基因的作用机理 62 3.2 植物抗真菌病R基因功能及应用策略 63 3.3 植物抗真菌病R基因及其应用 63 4 植物系统获得性抗性的抗病基因及其应用 64 4.1 SAR的作用机制 64 4.2 SAR的诱导基因 64 复习题 66 名词解释 66 问题 66 第8章 抗植物细菌病害基因及其应用 67 1 病原菌白身的抗性基因及其应用 67 1.1 作用原理 67 1.2 oct基因和tta基因及其应用 67 2 抗菌肽基因及其应用 67 2.1 抗菌肽的分子结构及其抗菌谱 67 2.2 抗菌肽的杀菌机制 68 2.3 抗菌肽基因的应用 68 3 防御素基因及其应用 68 3.1 防御素的结构与功能 68 3.2 防御素np-1基因及其应用 69 3.3 美洲商陆Pa-afp基因及其应用 69 4 溶菌酶基因及其应用 69 5 病原相关蛋白基因及其应用 69 5.1 PR蛋白的基本结构和功能 69 5.2 番茄pto基因的结构与功能 70 5.3 番茄ptil基因的结构与功能 70 6 植物保卫素合成酶基因及其应用 70 6.1 化合物保卫素的功能及其合成酶基因 70 6.2 活性氧的抗菌功能及其调控基因 70 7 类甜蛋白基因及其应用 71 7.1 类甜蛋白的成分和结构 71 7.2 TLP的作用机制和应用 71 7.3 tho基因的结构与功能 71 复习题 71 名词解释 71 问题 71 第9章 抗非生物胁迫基因及其应用 72 1 耐除草剂基因及其应用 72 1.1 抗EPSPS抑制剂基因 72 1.2 抗ALS抑制剂基因 73 1.3 草铵膦乙酰转移酶基因 73 2 抗非生物逆境基因及其应用 73 2.1 渗透调节物质合成酶基因及其应用 73 2.2 抗氧化保护酶基因及其应用 74 2.3 LEA蛋白基因及其应用 75 2.4 抗逆相关转录因子基因及其应用 75 2.5 信号因子及其应用 77 3 抗寒基因及其应用 78 3.1 抗冻蛋白基因 78 3.2 提高生物膜流动性的蛋白质基因 79 3.3 环境因素诱导表达的植物抗寒相关基因 79 4 耐瘠薄基因及其应用 80 4.1 耐低磷候选基因及其应用 80 4.2 耐低钾候选基因及其应用 81 复习题 81 名词解释 81 问题 81 第10章 影响作物产量、品质的基因及其应用 82 1 影响作物产量的基因及其应用 82 1.1 植物光合作用机制及提高作物产量的设想 82 1.2 影响作物光合作用的基因及其应用 82 1.3 植物产量形成的相关基因 84 2 影响作物品质的基因及其应用 85 2.1 谷物种子贮藏蛋白基因及其应用 85 2.2 影响淀粉品质的基因及其应用 86 3 调控果实成熟基因及其应用 87 3.1 多聚半乳糖醛酸酶 87 3.2 果胶酯酶 87 3.3 果胶裂解酶 88 3.4 纤维素酶 88 3.5 脂氧合酶 88 3.6 乙烯合成相关酶类 88 4 改良脂肪酸组成的基因及其应用 88 4.1 植物饱和脂肪酸合成途径及其改造 88 4.2 植物不饱和脂肪酸的合成途径及其改造 90 4.3 三酰甘油组装酶及其改造 90 4.4 影响种子含油量的调控因子 90 5 植物甜味蛋白及其应用 90 5.1 甜味蛋白的基因工程 90 5.2 环化糊精糖苷转移酶基因及其应用 91 复习题 91 问题 91 第11章 调控植物生长发育的基因及其应用 92 1 植物激素基因对植物生长发育的调控及其应用 92 1.1 生长素相关基因 92 1.2 细胞分裂素基因 93 1.3 赤霉素基因 93 2 光信号转导相关基因对植物形态建成的调控及其应用 94 2.1 光受体基因对形态建成的调控 94 2.2 cop1基因及其对光形态建成的负调控 95 2.3 hy5基因及其对光形态建成的正调控 95 3 调控胚胎发育及体细胞再生的基因及应用 95 3.1 调控胚胎发育的基因 95 3.2 胚胎发育基因在体细胞再生中的应用 96 4 调控叶片发育、衰老的基因及其应用 96 4.1 调控叶片发育的基因 96 4.2 调控叶片衰老的基因 97 5 调控植物花发育、衰老的基因及应用 98 5.1 调控植物花发育的基因 98 5.2 调控植物花衰老的基因及其应用 99 6 植物雄性不育基因及其应用 99 6.1 创建植物雄性不育的基因 99 6.2 雄性不育保持及恢复相关基因 100 复习题 101 名词解释 101 问题 101 第12章 植物生物产品基因工程 102 1 植物基因工程生物反应器 102 1.1 植物基因工程生物反应器的优点 102 1.2 植物基因工程产品的表达定位 102 2 酶合成植物基因工程 103 3 脂肪合成植物基因工程 104 3.1 不饱和脂肪酸的基因调控 104 3.2 饱和脂肪酸的基因调控 104 4 淀粉合成植物基因工程 105 4.1 催化淀粉合成的酶及其基因 105 4.2 改造或生产特定结构淀粉的基因 106 5 可降解塑料(PHA)合成植物基因工程 107 5.1 生物可降解塑料PHB的结构功能 107 5.2 PHA的生物合成及其基因调控 108 5.3 利用转基因植物生产PHA的策略 108 复习题 109 问题 109 第13章 植物医药基因工程及其应用 110 1 植物医药基因工程概述 110 1.1 植物医药基因工程的发现 110 1.2 转基因植物生产药物的优点 110 1.3 植物医药基因工程宿主植物的选择 110 1.4 重组蛋白在细胞中的定位 111 2 植物抗体基因工程及相关基因 112 2.1 抗体及其基因的结构与功能 112 2.2 抗体在转基因植物中的表达 113 2.3 植物抗体的应用前景 113 2.4 植物抗体存在的问题及研究方向 113 3 植物疫苗基因工程及相关基因 114 3.1 植物疫苗基因工程目的基因的选择 114 3.2 植物疫苗基因工程的研究进展及应用 前景 114 3.3 植物疫苗基因工程存在的问题及策略 116 4 转基因植物生产药用蛋白多肽 117 5 植物医药基因工程研究展望 117 复习题 118 名词解释 118 问题 119 部分近期参考文献 120 第三篇 目的基因分离克隆 第14章 基因序列同源性克隆目的基因 124 1 基因序列同源性克隆的原理 124 1.1 基因序列同源性克隆的种类 124 1.2 基因序列同源性克隆的原理 124 2 基因序列同源性克隆的程序 124 2.1 简并引物设计 125 2.2 克隆基因片段序列及同源性分析 126 3 目的基因全长克隆 126 3.1 cDNA末端的快速克隆（RACE技术） 126 3.2 染色体步移(chromosome walking)技术 129 4 基因序列同源性克隆的评述 130 复习题 130 名词解释 130 问题 130 第15章 基因芯片技术克隆目的基因 131 1 基因芯片概述 131 1.1 基因芯片的定义 131 1.2 基因芯片的特点 131 2 利用基因芯片技术分离目的基因 131 2.1 基因芯片技术分离目的基因的原理 131 2.2 基因芯片技术分离目的基因的操作流程 132 2.3 基因芯片技术在分离目的基因中的应用 134 3 基因芯片技术的其他应用 135 3.1 基因表达分析 135 3.2 大规模测序 135 3.3 突变体和多态性检测 135 3.4 基因文库作图 135 3.5 转基因产品检测 135 3.6 基因芯片技术的评价及发展前景 135 复习题 135 名词解释 135 问题 135 第16章 基因文库技术 136 1 基因文库概述 136 2 基因文库的类别 136 2.1 基因组文库和cDNA文库 136 2.2 克隆文库及表达文库 136 2.3 不同载体的基因文库 137 3 植物核基因组文库构建 137 3.1 DNA片段的产生和制备 137 3.2 构建基因文库的载体 138 3.3 应用X噬菌体载体构建基因组文库 138 4 植物cDNA文库构建 138 4.1 mRNA的制备 138 4.2 cDNA的合成 138 4.3 cDNA与载体的连接 139 5 人工染色体文库构建 140 5.1 人工染色体文库简介 140 5.2 酵母人工染色体(YAC)文库 140 5.3 细菌人工染色体(BAC)文库 141 5.4 可转化人工染色体(TAC)文库 142 6 基因文库筛选方法 142 6.1 核酸杂交法 142 6.2 免疫学检测法 143 6.3 同胞选择法 143 6.4 PCR筛选法 143 7 问题与展望 143 复习题 144 名词解释 144 问题 144 第17章 差异表达基因的分离技术 145 1 mRNA差异显示技术 145 1.1 mRNA差异显示技术的基本原理 145 1.2 mRNA差异显示技术分离差异表达基因的基本程序 146 1.3 mRNA差异显示技术的优点及局限性 146 1.4 mRNA差异显示技术的改进 147 1.5 mRNA差异显示实验中的注意事项 149 2 实时荧光定量PCR技术分离目的基因 150 3 RACE技术克隆全长目的基因 150 4 基因表达系列分析技术(SAGE)努离目的基因 150 4.1 SAGE的原理 150 4.2 SAGE操作程序 150 4.3 SAGE的特点分析及应用 151 5 差减杂交(SH)与抑制性差减杂交(SSH)技术分离目的基因 151 5.1 SSH的基本原理 152 5.2 SSH的操作程序 152 5.3 SSH的优点分析 153 5.4 SSH在基因克隆中的应用前景 153 复习题 153 名词解释 153 问题 153 第18章 插入突变技术分离克隆目的基因 154 1 插入失活筛选重组体 154 1.1 根据载体表型特征选择重组体 154 1.2 根据插入序列的表型特征筛选重组体 155 2 插入接头突变分离克隆目的基因 155 2.1 基本原理 155 2.2 具体操作 155 3 T-DNA标签法分离克隆目的基因 156 3.1 基本原理 156 3.2 操作及应用 156 4 转座子诱变分离克隆目的基因 157 4.1 转座子的基本概念 157 4.2 转座子的分粪和结构特征 157 4.3 转座机制 158 4.4 转座子的应用 159 5 插入突变的其他应用 162 复习题 162 名词解释 162 问题 162 第19章 图位克隆分离目的基因 163 1 图位克隆的基本原理 163 2 图位克隆的基本程序 163 3 图位克隆的主要技术环节 163 3.1 目的基因遗传作图群体的构建 163 3.2 筛选与目标基因连锁的分子标记 164 3.3 目的基因区域的精细定位和作图 166 3.4 目的基因克隆 167 3.5 目的基因的鉴定 168 4 图位克隆的研究进展 168 复习题 169 名词解释 169 问题 169 第20章 酵母双杂交系统分离克隆目的基因 170 1 酵母双杂交系统的基本原理 170 2 酵母双杂交系统的内容 171 2.1 酵母双杂交的组成 171 2.2 酵母双杂交的实验模式 171 2.3 酵母双杂交体系的寄主菌与质粒载体 171 3 酵母双杂交系统的特点分析 172 3.1 双杂交系统优点 172 3.2 酵母双杂交系统应用的局限性和存在的主要问题 173 3.3 酵母双杂交系统的改进 174 4 酵母双杂交系统的功能及其新技术 175 4.1 筛选与已知蛋白特异作用的成分 175 4.2 确定两个已知有生理作用的蛋白间的作用位点或结构域 176 4.3 酵母单杂交系统 176 4.4 反向双杂交技术 176 4.5 酵母三杂交系统 176 5 酵母双杂交系统的应用 177 复习题 178 名词解释 178 问题 178 第21章 功能蛋白组技术分离目的基因 179 1 功能蛋白组技术概述 179 2 蛋白质双向电泳技术 180 2.1 双向电泳原理 180 2.2 用于功能蛋白组研究的双向电泳系统 180 2.3 蛋白质双向电泳技术 181 3 功能蛋白氨基酸序列分析 183 3.1 概述 183 3.2 蛋白质指纹质谱分析 183 4 功能蛋白基因分离 184 4.1 聚合酶链式反应技术分离目的基因 184 4.2 核酸杂交筛选法分离目的基因 185 4.3 免疫学筛选法分离目的基因 185 复习题 187 名词解释 187 问题 187 第22章 基因分离克隆的新技术与选择策略 188 1 基因分离克隆的新技术 188 1.1 EST序列标签法分离克隆目的基因 188 1.2 EST表达标签法的原理 188 1.3 EST表达标签法的思路 188 1.4 EST表达标签法在植物研究中的应用 189 2代表性差异分析(RDA) 189 2.1 gDNA-RDA 190 2.2 cDNA-RDA 190 2.3 cDNA-RDA在植物基因分离克隆中的应用 191 3 TADSH技术 191 3.1 TADSH的基本原理 191 3.2 TADSH方法操作程序 191 3.3 TADSH方法特点 191 4 cDNA-DS技术（cDNA直选法） 192 4.1 cDNA-DS的基本原理与内容 192 4.2 cDNA直选法的操作程序 192 4.3 cDNA-DS方法的影响因素 192 4.4 cDNA直选法的应用及研究进展 193 5 cDNA-AFLP与cDNA-RAPD技术 193 5.1 cDNA-AFLP 193 5.2 cDNA-RAPD 194 6 基因鉴定集成法 194 6.1 IPGI技术的基本原理 194 6.2 IPGI的实验步骤 194 6.3 IPGI技术的优点 195 6.4 基因鉴定集成法的应用前景 195 7 目的基因分离克隆方法的评述与选择策略 195 7.1 植物目的基因分离克隆新方法评述 195 7.2 植物目的基因分离克隆方法的选择策略 197 复习题 198 名词解释 198 问题 198 部分近期参考文献 199 第四篇 植物基因工程载体及其构建 第23章 植物基因工程载体 202 1 植物基因工程载体概述 202 2 植物基因工程载体命名规则及种类 202 2.1 植物基因工程载体的命名规则 202 2.2 植物基因工程载体的种类及特性 202 3 载体的基本结构 203 4 RNA干扰表达载体 204 4.1 RNAi的分子机制 204 4.2 植物RNAi的特点 205 4.3 RNAi载体的设计及构建 205 4.4 RNA干扰的研究与应用展望 206 5 植物基因工程常用的质粒载体 207 5.1 植物基因工程常用的克隆载体 207 5.2 植物基因工程常用的表达载体 209 6 植物基因工程载体改进和优化 210 6.1 改进和优化启动子 210 6.2 增强翻译效率 210 6.3 消除位置效应 210 6.4 使用定位信号 210 6.5 利用内含子增强基因表达 210 复习题 211 名词解释 211 问题 211 第24章 植物基因工程载体的标记基因和报告基因 212 1 标记基因 212 1.1 标记基因概述及环境安全 212 1.2 标记基因的分类 212 1.3 常用的选择标记基因 214 1.4 转基因植物中选择标记基困的消除 215 2 报告基因 218 2.1 报告基因概述 218 2.2 氯霉素乙酰转移酶基因(cat) 218 2.3 荧光素酶基因(luc) 218 2.4 绿色荧光蛋白基因（gfp） 219 2.5 B葡萄糖醛酸糖苷酸酶基因(gus) 219 3 标记基因和报告基因的选择策略 219 复习题 219 名词解释 219 问题 219 第25章 Ti质粒载体及其构建 220 1 Ti质粒载体的结构与功能 220 1.1 T-DNA区域的基因结构与功能 220 1.2 Vir区操纵子的基因结构与功能 221 2 Ti质粒基因在转化中的调控作用 222 2.1 单链T-DNA的加T 222 2.2 T链复合体的形成 223 2.3 T链复合体的转运 223 2.4 T复合体靶向植物细胞核 224 2.5 农杆菌染色体基因对T-DNA转移的调控 224 3 Ti质粒的改造及载体构建 224 3.1 双元载体系统 225 3.2 载体卡盒 225 4 双元质粒Ti载体的新技术 225 4.1 双元Ti载体结构的优化 226 4.2 双元Ti载体的发展 227 4.3 双元Ti载体应用的展望 230 复习题 230 名词解释 230 问题 230 第26章 Ri质粒载体及其构建 231 1 Ri质粒载体的结构与功能 231 1.1 Ri质粒的酶切图谱 231 1.2 Ri质粒与Ti质粒的同源性 232 1.3 Vir区的基因结构与功能 232 2 Ri质粒T区的基因结构与功能 232 2.1 农杆碱型Ri质粒T-DNA区特点与功能 232 2.2 甘露碱型和黄瓜碱型T-DNA区特点 234 2.3 Ri T-DNA在转化体的整合机制 234 3 Ri T-DNA微型质粒的构建 235 复习题 235 名词解释 235 问题 235 第27章 植物病毒载体及构建 236 1 植物病毒载体概述 236 1.1 植物病毒载体特点 236 1.2 植物病毒载体分类 236 2 植物病毒载体的构建 241 2.1 基因替代置换 241 2.2 基因插入 242 2.3 融合抗原 242 2.4 基因互补 242 3 病毒载体的应用及评价 243 3.1 植物病毒载体表达系统在植物基因工程中的应用 243 3.2 植物病毒诱导的基因沉默系统(VIGS)在植物功能基因组研究中的应用 244 复习题 246 名词解释 246 问题 246 部分近期参考文献 247 第28章 植物基因转化受体系统的建立 250 1 植物基因转化受体系统的条件 250 1.1 高效稳定的再生能力 250 1.2 较高的遗传稳定性 250 1.3 具有稳定的外植体来源 251 1.4 对选择性抗生素敏感 251 1.5 对农杆菌侵染有敏感性 251 2 植物组织培养转化受体系统 251 2.1 植物组织培养转化受体系统的种类及其特性 251 2.2 植物组织培养转化受体系统建立的程序 253 2.3 植物组织培养转化受体系统建立的常见问题 255 3 植物非组织培养受体系统 258 3.1 植物生殖细胞受体系统 258 3.2 植物种子受体系统 259 3.3 植物茎尖分生细胞受体系统 259 3.4 植物质体受体系统 259 复习题 259 名词解释 259 问题 259 第29章 根癌农杆菌Ti质粒基因转化 260 1 根癌农杆菌的生物学特性 260 1.1 根癌农杆菌的形态结构、生活习性及寄主范围 260 1.2 根癌农杆菌的分类及鉴定 260 1.3 根癌农杆菌的遗传宿主及内共生原理 260 1.4 根癌农杆菌附着植物细胞的机制 261 2 根癌农杆菌侵染植物细胞的化学机制 261 2.1 根癌农杆菌的趋化性 261 2.2 根癌农杆菌侵染的诱导物及作用机制 261 2.3 冠瘿碱的化学特性及功能 264 3 根癌农杆菌的侵染能力及其特性 266 3.1 转化中常用的根癌农杆菌菌系及菌株 266 3.2 影响农杆菌侵染能力的内在因素 267 3.3 根癌农杆菌的侵染能力差异及植物的敏感反应 268 4 根癌农杆菌转化程序及操作原理 268 4.1 根癌农杆菌转化程序 269 4.2 根癌农杆菌的培养、纯化、保存及工程菌液制备 269 4.3 Vir区基因活化诱导物的使用 270 4.4 外植体的选择 271 4.5 外植体的预培养、接种及与农杆菌的共培养 272 4.6 外植体脱菌及选择培养 273 5 根癌农杆菌转化方法 274 5.1 整体植株接种共感染法 274 5.2 叶盘转化法 275 6 根癌农杆菌转化系统的评述 276 复习题 277 名词解释 277 问题 277 第30章 发根农杆菌Ri质粒基因转化 278 1 发根农杆菌的生物学特性 278 1.1 发根农杆菌的宿主及转化体的特性 278 1.2 发根农杆菌的分类及命名 279 1.3 毛状根是单细胞克隆体 279 1.4 发根农杆菌的冠瘿碱合成 280 2 发根农杆菌基因转化策略 280 2.1 共整合载体转化 280 2.2 双元载体转化 280 2.3 Ri质粒与Ti质粒的相容性 280 3 发根农杆菌基因转化的方法及操作原理 280 3.1 转化方法 281 3.2 毛状根的培养 281 4 发根农杆菌基因转化的影响因素 281 4.1 发根农杆菌种类之间侵染能力的差异 281 4.2 发根农杆菌Vir区基因的影响 282 4.3 发根农杆菌染色体基因的影响 282 4.4 宿主对发根农杆菌侵染的敏感性 282 5 发根农杆菌转化的应用 282 5.1 促进生根 282 5.2 增强抗逆性 282 5.3 次生代谢产物生产 282 复习题 283 名词解释 283 问题 283 第31章 植物病毒载体介导基因转化 284 1 植物病毒的生物学特性 284 1.1 植物病毒的种类及其特性 284 1.2 植物病毒的形态结构 285 2 植物病毒介导基因转化的原理 286 2.1 植物病毒的侵染机制 286 2.2 病毒在植物细胞内的装配 286 3 植物病毒介导基因转化的程序 287 3.1 病毒载体转化系统的基本条件 287 3.2 病毒载体转化系统的选择策略 287 3.3 病毒载体转化的方法 288 4 病毒载体与质粒载体转化系统的比较 288 4.1 病毒载体与质粒载体转化系统的异同 288 4.2 病毒载体的缺点 288 5 病毒载体转化系统的应用潜力 288 复习题 289 名词解释 289 问答题 289 第32章 DNA直接导入法基因转化 290 1 化学诱导DNA直接转化 290 1.1 PEG介导基因转化 290 1.2 脂质体介导基因转化 292 2 物理法诱导DNA直接转化 293 2.1 电激法介导基因转化 293 2.2 超声波介导基因转化 294 2.3 显微注射介导基因转化 295 2.4 激光微束介导基因转化 296 2.5 基因枪法介导基因转化 297 2.6 低能离子束介导植物基因转化 ～301 复习题 302 名词解释 302 问题 302 第33章 植物种质系统介导基因转化 303 1 花粉管通道法介导基因转化 303 1.1 花粉管通道法的提出 303 1.2 花粉管导人的原理 303 1.3 花粉管通道法的操作程序 304 1.4 对花粉管通道法的技术评价 304 2 花粉粒介导基因转化 305 2.1 花粉粒介导基因转化的原理 305 2.2 花粉粒介导基因转化的操作程序 305 2.3 花粉粒基因转化的优点及问题 306 2.4 花粉粒基因转化的应用 306 3 生殖细胞浸泡法介导基因转化 306 3.1 浸泡转化法的原理 306 3.2 浸泡转化法程序 307 3.3 浸泡转化法的技术评价 307 4 胚囊、子房注射法介导基因转化 308 4.1 胚囊、子房注射法的原理 308 4.2 胚囊、子房注射法的操作程序 308 4.3 胚囊、子房注射法的评述 308 5 萌发种子基因转化 309 5.1 萌发种子基因转化的原理 309 5.2 萌发种子胚基因转化方法 309 5.3 萌发种子基因转化的优缺点 309 5.4 萌发种子基因转化的应用前景 309 复习题 309 名词解释 309 问题 309 第34章 植物质体基因转化系统 310 1 植物质体基因转化系统概述 310 1.1 植物质体系统的定义 310 1.2 植物质体基因转化的研究历史 310 1.3 植物质体基因转化系统的优越性 310 2 叶绿体基因转化及原理 311 2.1 叶绿体基因组结构特点 311 2.2 叶绿体的转化方法及原理 311 2.3 叶绿体基因转化载体的特性 311 2.4 外源基因在叶绿体基因组的整合原理 312 3 外源基因在叶绿体基因组的表达 313 4 转化外源基因在叶绿体基因组的同质化途径 314 4.1 16S rRNA突变型细胞途径 314 4.2 利用筛选标记基因途径 314 4.3 利用花粉管导入途径 314 5 标记基因的选择及删除 314 5.1 选择筛选标记基因 314 5.2 筛选标记基因的删除 315 6 叶绿体基因工程的应用 315 6.1 提高光合效率 315 6.2 改良作物特性 316 6.3 生产药物及工业生物产品 316 7 存在问题及展望 316 7.1 转化效率低 316 7.2 叶绿体同质化困难 317 7.3 展望 317 复习题 317 名词解释 317 问题 317 部分近期参考文献 317 第六篇 转基因植物的检测 第35章 标记及报告基因的表达检测 320 1 抗生素抗性基因检测 320 1.1 β-葡萄糖苷酸酶基因gus的检测 320 1.2 氯霉素乙酰转移酶基因cat的检测 322 1.3 77pt-II基因的检测 323 2 抗除草剂基因检测 324 2.1 pat基因的检测原理 324 2.2 检测方法 325 3 生化代谢基因检测 325 3.1 冠瘿碱合成酶基因的检测 325 3.2 萤光素酶基因的检测 325 3.3 二氢叶酸还原酶基因的检测 326 4 生物安全性标记基因检测 326 4.1 磷酸甘露糖异构酶基因(pmi)的检测 326 4.2 木糖异构酶基因(xyla)检测 327 4.3 甜菜碱醛脱氢酶(BADH)基因的测定 327 4.4 绿色荧光蛋白基因gfp的检测 328 复习题 328 名词解释 328 问题 328 第36章 外源基因整合检测 329 1 外源基因整合的Southern杂交鉴定 329 1.1 植物DNA提取 329 1.2 杂交探针的制备 330 1.3 Southern印迹杂交 332 1.4 Southern印迹杂交结果分析 335 2 整合外源基因拷贝数的IPCR检测 337 2.1 IPCR的原理 337 2.2 IPCR技术要点 337 3 整合外源基因实时荧光定量PCR检测 337 3.1 实时荧光定量PCR概述 337 3.2 实时荧光定量PCR的基本概念 338 3.3 实时荧光定量PCR的化学原理 338 3.4 应用SYBR Green l法进行基因整合检测（绝对定量分析） 340 4 整合外源基因的原位杂交 340 4.1 染色体DNA原位杂交原理 341 4.2 染色体DNA原位杂交方法 341 复习题 341 名词解释 341 问题 341 第37章 外源基因的表达检测 342 1 外源基因转录的Northern杂交检测 342 1.1 植物RNA提取 342 1.2 探针制备 344 1.3 Northern斑点杂交 344 1.4 Northern印迹杂交 344 2 外源基因表达的RT-PCR检测 345 2.1 原理 345 2.2 RT-PCR反应程序 345 3 外源基因表达蛋白的检测 345 3.1 ELISA检测 345 3.2 免疫荧光技术检测 346 4 表达蛋白的含量测定 346 5 Western杂交检测 347 5.1 Western杂交原理 347 5.2 Western杂交程序 347 5.3 Western印迹实验设计 348 6 外源基因表达的原位杂交检测 348 6.1 组织细胞mRNA原位杂交 348 6.2 外源基因表达蛋白的组织细胞免疫定位 349 6.3 组织印迹的Northern及Western杂交 349 复习题 350 名词解释 350 问题 350 第38章 转基因植物的生物学特性检测 351 1 转基因植株外源基因纯合和嵌合性检测 3 5 1 1.1 转基因植株外源基因纯合体检测 351 1.2 转基因植株嵌合体检测 355 2 转基因植物遗传多样性检测 355 2.1 RFI P检测分析原理 355 2.2 RAPD检测分析原理 356 2.3 SSR标记分析转基因植株的遗传多样性 356 3 转基因植株的目的性状检测 358 3.1 生理生化检测转基因植物的目的性状指标 358 3.2 转基因植物目的性状的生物学鉴定 358 4 转基因植物稳定性检测 359 复习题 359 名词解释 359 问题 359 部分近期参考文献 360 第七篇 转基因植物的遗传特性及其安全性 第39章 外源DNA在转基因植物中的整合特性 362 1 外源DNA的整合特点 362 1.1 外源DNA整合的随机性 362 1.2 外源DNA整合的规律性 362 1.3 农杆菌介导法的整合特点 363 1.4 基因枪法的整合特点 363 1.5 花粉管通道法的整合特点 364 2 外源DNA的整合机制 364 2.1 T-DNA整合的机制 364 2.2 直接导入法外源DNA整合的分子机制 365 3 外源DNA的整合方式及结构变化 367 3.1 外源DNA的整合方式 367 3.2 转化后外源DNA的结构变化 368 4 外源DNA整合的效应 369 4.1 位置效应 369 4.2 重组效应 369 4.3 转基因拷贝数的效应（剂量效应） 370 4.4 转基因沉默 370 5 外源基因的删除 370 5.1 共转化法 370 5.2 转座子法 370 5.3 位点特异性重组法 371 5.4 染色体内同源重组法 372 5.5 几种方法的比较和评价 372 6 提高外源DNA有效整合的技术 372 6.1 定点重组转基因技术简介 372 6.2 定点重组转基因技术的主要类型 372 6.3 位点特异性重组的作用机制 373 6.4 位点特异性重组的应用 373 复习题 374 名词解释 374 问题 374 第40章 外源基因在转基因植物中的表达特性 375 1 外源基因的瞬时表达 375 1.1 瞬时表达的过程 375 1.2 瞬时表达的机制 375 1.3 植物瞬时表达的技术 376 1.4 瞬时表达的应用 376 2 外源基因的稳定表达 377 2.1 外源基因稳定表达的特点 377 2.2 外源基因稳定表达的类型 377 3 同源性和异源性外漂基因的表达 378 3.1 同源性外源基因的表达 378 3.2 异源性外源基因的表达 379 4 外源基因的沉默 379 4.1 转基因沉默的表现 379 4.2 转基因沉默的机制 379 5 外源基因的整合方式对其表达的影响 381 5.1 外源基因的整合位置 381 5.2 外源基因的拷贝数 381 6 优化外源基因表达的策略 381 6.1 启动子的合理选择 381 6.2 目的基因的修饰 382 6.3 信号肽序列的利用 382 6.4 特殊序列的恰当使用 382 6.5 利用优良的转化方法和重组系统 383 复习题 383 名词解释 383 问题 383 第41章 外源基因的遗传特性及其利用 384 1 外源基因的遗传规律 384 1.1 孟德尔式遗传 384 1.2 非孟德尔式遗传 385 2 外源基因的遗传稳定性 387 2.1 转基因在转化细胞中的稳定性 387 2.2 转基因在遗传传递中的稳定性 387 2.3 辖基因植株的倍性变化 388 2.4 沉默转基因的遗传稳定性 388 3 影响外源基因遗传特性的因素 388 3.1 环境条件 388 3.2 转化方法 389 4 转基因材料在遗传育种中的应用 389 4.1 转基因材料在遗传学研究中的利用 389 4.2 转基因材料的育种利用 390 4.3 转基因材料的基因聚合利用方法 392 4.4 快速利用转基因材料的技术 392 复习题 393 名词解释 393 问题 393 第42章 转基因植物的安全性 394 1 转基因生物安全性概述 394 1.1 生物安全的定义 394 1.2 转基因生物的安全性评价 394 1.3 转基因生物安全等级的划分 395 2 转基因植物的基因元件安全性 395 2.1 目的基因的安全性 395 2.2 标记基因的安全性 395 2.3 调控元件的安全性 396 2.4 载体骨架序列的安全性 396 3 转基因植物的环境安全性 396 3.1 生存竞争能力 396 3.2 基因漂移的环境影响 397 3.3 转基因植物的功能效率评价 397 3.4 对生物多样性的影响 397 3.5 产业化后的环境监测与风险管理 398 4 转基因植物的食品安全性 398 4.1 转基因食品安全 398 4.2 转基因植物食品安全性的评价内容 398 5 转基因生物安全管理 399 5.1 国外转基因生物安全管理 399 5.2 我国转基因生物安全管理 399 6 转基因生物安全的风险交流 400 6.1 风险交流的定义 400 6.2 风险评估、风险管理和风险交流之间的关系 400 7 转基因生物安全事件澄清 401 7.1 Pusztai事件 401 7.2 大斑蝶事件 401 7.3 转基因玉米品种对大鼠肾脏和肝脏毒性事件 401 复习题 401 名词解释 401 问题 401 部分近期参考文献 401 第八篇 生物信息学与植物基因工程 第43章 生物信息学概述 406 1 什么是生物信息学？ 406 1.1 生物信息学概念 406 1.2 生物信息学的研究内容 406 2 生物信息学发展简史 408 3 生物分子数据库 408 3.1 基因组数据库 409 3.2 功能数据库 409 4 生物信息学在植物基因工程中的应用 410 4.1 生物信息学在基因信息挖掘中的应用 410 4.2 生物信息学在基因克隆中的应用 410 4.3 生物信息学在转基因植物表达分析中的应用 411 4.4 生物信息学在整合外源基因结构功能分析中的应用 411 复习题 411 问题 411 第44章 生物信息学与基因结构功能分析 412 1 序列同源性分析 412 1.1 序列比对 412 1.2 进化树分析 413 2 基因完整性分析 414 3 基因结构域分析 414 4 启动子分析 414 4.1 在线搜索的方法 415 4.2 本地运行方法 415 复习题 416 问题 416 第45章 生物信息学与植物基因分离克隆 417 1 植物基因组与基因信息获取 417 1.1 TAIR库资源的获取 417 1.2 GenBank库资源的获取 417 2 分子标记和基因组数据分析 418 2.1 基因表达数据分析与候选基因筛选 418 2.2 基因芯片数据分析 418 2.3 Next-generation sequencing (NGS)数据分析 419 3 基因克隆中的生物信息学方法 421 3.1 PCR引物设计方法 421 3.2 电子克隆基因 422 复习题 424 问题 424 第46章 生物信息学与蛋白质结构功能分析 425 1 蛋白质结构数据库 425 1.1 PROSITE 425 1.2 PDB 425 1.3 SCOP 425 1.4 CATH 425 1.5 PIR和PSD 426 1.6 SWISS-PROT 426 1.7 COG 426 2 蛋白质结构预测 426 2.1 蛋白质二级结构预测的方法及软件 426 2.2 蛋白质三级结构预测的方法及软件 427 3 蛋白质功能预测 428 3.1 蛋白质功能预测方法 428 3.2 蛋白质结构与功能关系数据库 428 复习题 429 问题 429 部分近期参考文献 430 植物基因工程申英文名词对照 431
绪论植物基因工程概述
自开天辟地以来，浩瀚地球惊天动地的变迁孕育着生命的诞生。在漫长的生物进化历程中树起的丰碑是历史的见证（图01）。分子生物学的问世揭示了基因是生命之源。在大自然的生物进化过程中，自然力量的胁迫驱使基因不断发生突变、重组、转移及选择，从而推动生物界无止境的进化，形成了今天五彩缤纷的生物界。因此，生物进化是伴随着基因变异的轨迹缓步而进。生命科学的飞速发展，创立了现代分子生物学。基因工程技术的建立，为人类改造生物开辟了崭新的途径，预示着生物进化史从自然进化产生人类，发展到了人类改造自然的科学顶峰时期。基因工程将使整个生物界发生重大变革，这足以说明基因工程的巨大威力。顾名思义，植物基因工程是改造植物的科学，它也是与基因工程发展结伴而行的领先者。 图01植物基因工程研究发展史事 1植物基因工程的定义 随着分子生物学的诞生，基因工程问世。所谓基因工程（genetic engineering）是指从生物体中（供体）分离克隆基因或人工合成基因，再与载体DNA拼接重组，并将其导入到另一种生物体内（受体），使之按照预先的设计持续稳定表达和繁殖的遗传操作。因此，供体、受体和载体成为基因工程的三大要素。基因克隆、重组和转化是其三大核心技术。来自供体的基因属于外源基因。由于基因工程是改造生物的遗传特性，故也称为遗传工程(genetic engineering)、遗传修饰(genetic modification)及基因操作(gene manipulation)等。从工程学的范畴而言，基因工程是DNA操作技术的产业化设计和应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。上游技术指的是基因分离克隆、重组和载体构建，而下游技术则涉及基因转化、表达及受体培养和表达产物的分离提取技术。 植物基因工程是基因工程研究的一个先导领域。基于植物细胞全能性的确立、农杆菌Ti质粒转化系统的发现、多种基因转化技术的建立及植物与农业的密切相关性，植物基因工程的发展迅速，并逐渐自成体系，成为一门理论与技术紧密结合的完整学科。确切地说，植物基因工程是植物分子生物学的一门分支学科，植物基因工程（plant genetic engineering）的定义是利用基因工程理论技术，从供体分离克隆的外源基因，在体外与载体DNA重组后，经遗传转化导入受体植物基因组中，并获得有效表达及稳定遗传的工程。转基因植物（genetically modified plant，GMP）是指通过基因工程技术改变基因组构成的植物。该植物是农作物，即称为转基因作物 (genetically modified crop，GMC)。转基因生物（genetically modified organism，GMO）是广义的，指转基因的动物、植物及微生物。 由此可见，植物基因工程的目的意义是按照人们的愿望进行严密的设计，有目的地改造生物种性，培育出符合人们需求的基因工程新品种，生产所需的产品。 2植物基因工程的研究发展历史 纵观基因工程的发展历程编绘了植物基因工程研究发展大世纪（图01），图中表明基因工程的研究是伟大的科学家遗传学之父孟德尔（G.J.Mendel，1822～1884）从研究豌豆开始的，也是植物基因工程研究的起点。1865年，孟德尔发现了遗传因子及遗传的三大规律。令人遗憾的是，这天才的发现在他逝世后的半个多世纪内几乎无人理，直到1900年欧洲三位植物学家重新发现孟德尔遗传定律，他才被公认为经典遗传学的奠基人。而后，孟德尔遗传定律像不朽的神话故事流芳百世，推动着基因遗传学的发展。除此之外，丹麦植物遗传学家约翰森（Johannsen）在1909年提出“基因型”（genotype）和“表现型”（phenotype）的概念，并为基因型定下了一个单位“基因”（gene），从此正式拉开了基因工程研究的序幕。显然，植物基因工程是基因研究的开拓者，但是植物基因工程是基因工程的一门分支学科，依托于基因工程而发展。其研究发展史同样可以分为以下三个时期。 21植物基因工程理论形成期〖*2〗 211DNA分子结构功能的创立 在孟德尔的基础上，1910年，摩尔根（Morgan）在果蝇的研究中第一次提出了基因学说，铺下了基因工程的奠基石。但是在相当长的时间里，对基因的理解仍是抽象的，概念化的。1944年，美国的微生物学家格里菲思（Griffith）和艾弗里（Avery）等通过细菌转化研究，证明DNA是遗传物质，是基因的载体。DNA的真正身份得到了确认，但更大的难题出现了：DNA的结构是什么样子？此后对DNA构型的研究成为当时科学界最大的热点之一。令人惊异的是能回答如此重大问题的竟是发表在英国《自然》杂志上一篇长不到一千个单词的论文，并且论文的作者名不见经传：一位25岁的美国博士后沃森（Watson）和一位37岁的英国剑桥大学的研究生克里克（Crick）。更值得惊讶的是他们不是常规地进行生物实验，而是如同小孩玩的拼图游戏，把一张图画割裂后再拼复成更美的图画。然而一些愚昧的非议阻挡不了这篇论文的真正魅力，相反却正是表明伟大的天才创新思维。1952年，英国国王学院的科学家威尔金斯（Wilkins）通过DNA分子X 衍射研究获得了DNA结构的重要证据，但是DNA分子结构模型仍不清楚。经历了10年的不懈努力，于1953年Watson和Crick开创性地提出了DNA分子的双螺旋模型（图02）。这是分子生物学发展史上如春雷一般撼动世界的伟大发现。从此生命科学家茅塞顿开，新的科学发现屡见不鲜， 各类证明DNA结构的实验证据纷至沓来，真是一智能灭千年愚。1954年，Crick又提出了中心法则，揭示了遗传信息的传递规律。从而Watson和Crick及Wilkins这三位科学家一起获得了诺贝尔生理学或医学奖。1958年，大科学家Meselson等用超速密度离心的技术证明了DNA通 图02Watson和Crick提出了 DNA分子的双螺旋模型 过半保留方式复制。该实验被誉为生物史上最漂亮的实验之一。1961年，法国科学家Jacob和Monod提出操纵子(operon)学说，并发现了mRNA，同时美国科学家Nirenberg首次破译了64种遗传密码，成功地揭示了遗传信息的流向和基因表达调控的方式，从而为基因工程问世奠定了理论基础。 212DNA表达、重组理论的建立 DNA双螺旋模型的提出，遗传密码的破译，mRNA及操纵子的发现，中心法则及基因表达调控学说的确立，都发生在短短的十余年时间里。科学家好像如梦初醒、茅塞顿开，突然读懂了上帝撰写的无字天书。从此，生命科学进入分子生物学的新时代。理论发展必然会指导实践，应用于生产，因此生物技术、基因工程技术的创新应运而生。 1956年，华盛顿大学教授科恩伯格（Kornberg）利用大肠杆菌的细胞液，在体外合成DNA。两年后他又从中分离出DNA聚合酶，从而开拓了分子生物学的另一片新天地——基因操作技术。为此，诺贝尔生理学或医学奖的桂冠一年后就献给了科恩伯格。1970年，霍普金斯大学的科学家Smith等发现了限制性内切酶，同年，Temin等发现了反转录酶，接着1973年Cobeng等建立了质粒重组DNA技术，使切割DNA成为可能，此时已万事俱备只欠东风。这些新的发现激发无数科学家产生了体外重组DNA，再导入宿主细胞，并在其中进行复制和有效表达的构想。东风来自美国的西海岸。斯坦福大学的教授Berg是研究DNA重组技术的元老。他研究发现了质粒是承载外源DNA片段的理想载体，病毒和噬菌体的DNA和RNA都可以改建成载体。1974年，他在世界上最早获得了重组有编码哺乳动物激素基因的质粒，并导入大肠杆菌，获得了第一株基因工程菌株。1980年，Sanger因设计出一种测定DNA分子内核酸序列的方法而与Gilbert和Berg荣获诺贝尔化学奖。这一切DNA重组技术的创举为基因工程问世做好了技术准备，也为植物基因工程奠定了基础。 213农杆菌基因转化机制的认知 率领植物基因工程研究发展的生长点是对植物冠瘿瘤的发生机制的认识。这是自然界存在的巧夺天工的植物基因工程典范。早在1907年美国科学家布朗（Armin Bran）研究提出农杆菌把“肿瘤诱导物”（tumorinducing principle，TIP）传递给了植物，即根瘤细胞是被农杆菌转化了的植物细胞，并推测被转换的肿瘤诱导物是DNA，这就是TIP假说。这天才的推测30年后才被证实。布朗被誉为“根癌病研究之父”。1970年，法国科学家证明诱导物DNA是编码氨基酸衍生物冠瘿碱合成酶的基因，证实了TIP假说的正确性。但是用农杆菌的DNA来转化植物的尝试接二连三地失败。1974年，比利时科学家van Larebeke等发现了“农杆菌的肿瘤诱发质粒”（tumorinducing plasmid，Ti质粒）。Ti质粒的发现如同一剂强心针唤醒了美国西海岸华盛顿大学的科学家们。他们成立了“西雅图根癌集团”（Seattle Crown Gall Group），全心致力于农杆菌转化的植物基因工程研究。然而他们同样是经受了失败的困扰，多年的努力在植物的肿瘤组织中找不到Ti质粒DNA。但是Chilton等没有气馁，坚持不懈，终于在1977年发现了“肿瘤诱导物”来自Ti质粒上的TDNA（transferred DNA）。接着阐明了冠瘿瘤形成的机制是通过农杆菌介导把TDNA致病基因转化到植物细胞，并在植物细胞中表达合成冠瘿碱，供给农杆菌生长繁殖所需的氮源，故有人将这个过程称为分子内共生或遗传寄生(genetic colonisation)。这是自然界中存在的极为巧妙的植物基因工程遗传转化体系。这一发现是植物分子生物学发展史上一个重大的里程碑，也是植物基因工程新纪元的开始。 22植物基因工程的问世期 1977年，农杆菌TDNA的发现及其转化机制的阐明， 对分子生物学及基因工程都有十分重大的意义。它首次证明了单细胞生物在自然环境下能够跨越原核生物与真核高等植物的界限发生基因重组， 至今尚未发现第二个类似的例子。更值得注意的是“西雅图根癌集团”的首席科学家，美国科学学院的玛丽·德尔·奇尔顿(Mary Dell Chilton)在论文中明确指出了这个发现的重要应用价值：“这个能够被转移的元件可用来当作今后高等植物基因工程研究载体的可能性是显而易见的。”从此植物基因工程研究成为当时的热点。 1983年1月，在迈阿密召开的植物与动物分子遗传学讨论会上发表的三个重要报告标志着植物基因工程新纪元的开始。比利时根特大学的Mantaga教授及Monsanton公司科学家Fraley领导的小组都分别将TDNA上的致癌基因切除，代之以外源基因，实验结果证明TDNA可以将外源基因转入植物基因组。世界上第一株农杆菌介导的转基因植物烟草在美国圣路易斯大学诞生，与此同时，美国华盛顿大学教授Chilton领导的研究小组取得了另一项突破性的进展，将细菌的新酶素磷转移酶（NPTⅡ）基因转入植物细胞后，植物细胞可抗卡那霉素（Kan）。与此相关的论文分别发表于Nature，1983，303;Nature， 1983，304;EMBO， 1983。该转基因植物烟草的获得，标志着植物基因工程的问世。直至当今，国际粮农组织对30年前揭示农杆菌Ti质粒基因转化机制，并获得第一株转基因植物的三位科学家（有的科学家已去世）（图03）授予了25万美元的崇高世界粮食奖，奖励他们对世界农业的巨大贡献——开启农业生物科技新时代。 图03三位获奖者：Marc van Montagu、Robert Fraley和Marry Dell Chilton 23植物基因工程的发展期 1983年，第一个转基因植物烟草成功后，各种转基因植株的获得如雨后春笋，转基因技术也迅速发展。1985年，Horsch等首创了由根癌农杆菌介导的烟草叶盘法转化技术(leaf disc transformation)。198
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